Gdy zapada noc, przewodnicy kończą pracę i idą do domu, a szkolne wycieczki kończą zwiedzanie, w waszyngtońskim Instytucie Smithsonian dzieje się coś niezwykłego. Nocny strażnik Larry Daley (w tej roli Ben Stiller) przeżyje największą przygodę swego życia. W drugiej części „Nocy w muzeum" Larry stoczy epicką walkę, która mogła się odbyć tylko w największym kompleksie muzealnym na świecie. Daley będzie musiał stanąć w obronie przyjaciół-eksponatów.